生物药免疫原性的发生机制与评价体系

本文讨论生物药引起的非预期免疫反应，重点是治疗性蛋白及其衍生物，包括单克隆抗体、融合蛋白、替代性酶和与内源蛋白相对应的重组产品。疫苗希望诱导的特异性免疫反应不在此范围；细胞与基因治疗中的载体、转基因产物和细胞免疫排斥也不能直接套用本文的蛋白药物检测框架。FDA与中国指导原则采用的免疫原性概念均较“产生抗体”更宽，包含对药物或相关蛋白的免疫应答以及免疫相关不良事件；ADA检测则主要观察这一问题中的体液免疫部分。[1,2,4]

评价体系应依次回答三个层次的问题。第一，哪些过程使这一产品在这一人群中具备引发反应的可能性？第二，研究是否以足够可靠的方式观察到了抗体的发生和演变？第三，这些反应是否影响了药代动力学（PK，药物的体内处置与浓度变化）、药效动力学（PD，药物引起的生物效应）、疗效或安全性？前两层为第三层提供证据，却不自动决定第三层的答案。本文选择聚集蛋白机制研究、抗TNF临床观察、婴儿型Pompe病酶替代研究以及少量机制明确的安全事件作为代表，分别说明耐受破坏、测量依赖和临床后果，不据其抗体阳性比例排列产品优劣。

有效的ADA应答需要抗原接触、免疫细胞激活及反应延续的条件共同成立。一个重要路径起始于抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞，对药物分子或颗粒的摄取。摄入的蛋白在细胞内被加工成肽段，其中部分与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子结合；在人类中常讨论HLAⅡ类分子。肽–HLA复合物被展示到细胞表面，具有匹配T细胞受体的CD4阳性T细胞才可能识别它。完整蛋白的空间表面与呈递给T细胞的线性肽段是不同对象，这也是B细胞表位与T细胞表位不能混为一谈的原因。[5]

B细胞首先借助表面的B细胞受体识别药物的可接近表位。这些表位可以由蛋白折叠后相邻的不同片段共同构成，也可以包括修饰或糖结构。结合之后，B细胞摄取抗原、加工蛋白并呈递肽段；已被激活的辅助性T细胞若能识别该B细胞呈递的相关肽，便可能通过接触信号和细胞因子帮助B细胞扩增和分化。这里需要的是对同一被摄取抗原的关联识别，并不要求T细胞和B细胞识别相同的一段结构。[5]

免疫原性也不是只有一种完整的经典应答路径。高度重复排列的表位可能增加B细胞受体的交联，为直接B细胞激活提供条件；但在蛋白药物语境中，把这一路径简单称作“无T细胞参与”可能过度推断。van Beers等在表达人体干扰素β、对其具有耐受的转基因小鼠中观察到：不同聚集状态的产品产生不同结合抗体反应，而该模型中未检测到中和抗体或再次挑战后的增强应答。[6] 随后的Kijanka等研究却发现，同类耐受模型的早期抗体形成需要CD4阳性T细胞，且可出现生发中心，同时仍缺乏典型的抗原特异性记忆增强。[7] 这些结果说明，ADA形成可以同时呈现若干T细胞依赖和非经典特征，生发中心、抗体分泌与记忆形成需分别观察。把这些模型环节用于解释人体产品时，还需以其耐受背景和临床纵向资料建立联系。

免疫耐受是免疫系统能够识别特定抗原，同时维持不发生有害应答的状态。中枢耐受在淋巴细胞发育过程中减少对自身成分具有强反应性的细胞；外周耐受则依赖低反应状态、缺乏充分共刺激、调节性细胞及其他抑制机制。正常生理状态下接触自身蛋白支持耐受形成；蛋白的存在量、组织分布、表位加工和淋巴细胞接触机会，则影响这种耐受覆盖哪些形式和表位。[1,3]

替代治疗尤其能显示内源抗原与耐受之间的关系。若疾病使患者不表达某个内源蛋白，治疗用的正常蛋白对于其免疫系统可能更接近一个新的抗原；如果患者仍表达失去催化活性的蛋白，则可能保留对部分表位的耐受。Pompe病由酸性α-葡萄糖苷酶（acid α-glucosidase，GAA）缺陷引起，溶酶体内的糖原清除受到影响；替代酶需要进入细胞并到达相关作用部位。这里的交叉反应免疫物质（cross-reactive immunologic material，CRIM）状态用于区分能否检出内源GAA蛋白，并不等同于该蛋白具有正常功能。CRIM状态提供宿主抗原表达的信息，抗体的持续强度、功能及疾病进展资料则进一步区分这一背景内的风险差异。[9,10]

聚集并不是一个具有单一生物作用的材料名称。可溶性寡聚体、亚可见颗粒与较大颗粒在数量、尺寸、表面形态、蛋白构象和化学变化上不同。它们可能增加重复表位的密度，改变抗原摄取，改变加工后肽段的数量或组合，并在某些条件下促进抗原呈递细胞成熟。这些变化可在同一样品中并存。解释聚集相关反应时，需要沿材料属性、抗原摄取、呈递和细胞激活追踪作用位置；人体风险的大小还取决于实际暴露与宿主条件。

研究分别设置了不同读出。树突状细胞分支观察人单核细胞来源细胞的成熟标志；MHC相关肽蛋白组学（MAPPs）分支在外加LPS成熟刺激的背景下，观察HLA-DR所呈递的药物来源肽；另一分支观察体外T细胞反应。成熟标志、实际呈递和T细胞反应对应不同对象，各分支处理条件也需分别理解。[5]

分子化学变化还可在聚集之外改变识别对象。氧化、脱酰胺等可能改变残基化学性质、局部构象和稳定性，进而影响蛋白的加工、肽呈递或聚集倾向；融合蛋白的连接区把原有片段置于新的结构环境，可能引入连接区表位，某些应答还可扩展至其他相连区域。糖基化一方面可增加溶解度、降低聚集并遮蔽部分蛋白表位，另一方面，特定非人糖结构本身可成为抗体识别对象。聚乙二醇（PEG）修饰同样可降低部分蛋白表面的可接近性，但抗PEG反应可能影响修饰药物的处置与活性。产品评价因而需分别观察蛋白主体、连接关系、糖或其他修饰的识别，以及这些变化对材料状态的影响。[1]

工艺相关杂质可作为独立抗原，也可能改变应答环境。宿主细胞蛋白、残留核酸、微生物来源成分和其他污染物不能用同一个机制概括；某些成分能够刺激先天免疫，某些成分主要提供外来抗原，另一些成分可能通过促进产品降解或颗粒形成间接影响风险。制剂辅料、容器浸出物和临床使用时的材料接触同样需要放到具体产品状态中解释。因此，杂质的性质、水平、活性与变化，需要与其可能提供的抗原、先天免疫刺激或产品损伤路径对应起来。[1,3,4]

评价抗体时，重点常包括独特抗原结合区、完整分子与片段的抗体结合、靶点及Fc相关因素，以及免疫复合物对药物处置的影响。替代酶除需观察结合外，还要区分抗体是否抑制催化活性、阻断细胞摄取或改变组织递送。替代细胞因子、激素和其他内源蛋白对应物，需要特别关注抗体是否同时中和具有重要生理功能的内源蛋白。相同的NAb阳性，在“失去外源治疗作用”和“同时失去正常生理功能”两种情形下，后果严重性明显不同。[1,3,9,11]

遗传差异既影响抗原呈递，也影响内源对应蛋白是否存在。年龄、免疫系统成熟或衰减、炎症活动、感染与免疫功能受损均可改变应答环境。适应证改变患者群体与治疗条件，同一药物的ADA资料也需按这些背景分别解释。炎症较活跃的人群可能获得较强共刺激，但疾病严重程度、蛋白丢失、靶点负荷和伴随治疗又可能同时改变暴露和抗体可检测性。疾病因素因此既是生物学影响因素，也可能是解释临床关联时的混杂因素。[1,3]

给药途径改变抗原最初接触的组织和细胞，给药频率与持续时间改变抗原暴露及再次刺激的机会。皮下、静脉及其他途径的风险必须结合产品、制剂和人群评价，不能作为跨产品绝对排序。间歇给药和长时间停药后再暴露可能改变既有反应，也会改变采样时药物干扰的程度。暴露量的作用同样并非统一单调规律：更充分的抗原接触、药物自身的免疫调节作用和检测遮蔽可以朝不同方向影响观察结果。[1,3]

分层检测首先使用较敏感的结合抗体筛查，以减少低水平反应被遗漏。筛查信号可以来自真正ADA，也可能来自非特异性结合或样本基质。因此，筛查阳性用于选择需要确证的样本，最终ADA状态由结合特异性等资料共同形成。确证层通常利用药物竞争等方式，检验该信号是否与药物特异性结合一致。结合两层结果后，才能形成样本级ADA结论。[2–4]

检测格式规定信号如何形成。桥联格式依靠ADA同时结合捕获药物与带标记药物，使被保留的标记形成可读信号；使用抗人免疫球蛋白二抗的间接结合格式，则通过二抗识别已经结合药物的抗体，检出范围受二抗的同种型覆盖影响。液相结合格式减少某些固定化相关的表位变化，但洗涤、分离与抗体解离速度仍会影响回收。ELISA或电化学发光主要描述读出平台，桥联或间接结合描述分子连接方式，两者属于不同层级。[2,4]

确证阳性样本的滴度用于描述反应强度。典型滴度是样本经过系列稀释后，仍满足阳性判定的最高稀释比例的倒数（例如1:1000对应滴度1000），或按预定规则由稀释曲线推得的值。它是依赖方法的准定量结果：不同抗体的亲和力、表位、类别和多价结合方式，会使相同质量浓度产生不同信号。因而，同一方法内的纵向滴度变化通常比跨方法比较“1:1000”和“1:2000”更可解释；将滴度解释为抗体质量浓度，需要与相应抗体及方法特征匹配的额外校准。[2,13]

中和检测进一步询问这些抗体在指定体系中是否阻断药物功能。药物若刺激受体信号，NAb可表现为相应信号下降；药物若阻断某个配体或受体，NAb反而可能恢复原先被抑制的信号。中和读出的方向由药物原来的作用决定。细胞体系较接近药物作用过程，但容易受细胞状态和样本内其他活性因子影响；配体结合或酶活性体系更直接地观察某个关键功能，却可能遗漏摄取、信号传递或其他作用环节。选择应由作用机制和需要排除的替代解释决定。[2]

样本内残留药物能够占据ADA的结合位点，或使抗体以药物–抗体复合物形式存在。在需要ADA连接捕获药物与标记药物的桥联格式中，这会减少可供检测的结合能力，造成低估或假阴性。药物本身、可溶性靶点和其他内源成分也可能引起非特异性信号；在某些检测格式中，药物靶点形成的连接还能模拟抗体桥联。因此，药物干扰不仅是“信号被遮住”的问题，也包括信号来自错误对象的可能性。[2]

这一区别直接影响阴性结果的含义。FDA于2026年发布的免疫原性–PK数据集技术规范在其推荐的数据框架中，明确将样本级最终ADA结论与检测条件联结，需考虑检测耐受能力相对于药物浓度是否充分；不足时应使用“inconclusive”等不确定状态，而不能简单把无法可靠判定的样本归入阴性。受试者级状态再由其所有样本按预先定义规则推导。缺失样本、检测受干扰和真正阴性因而应分别保留，才能避免将未充分观察的反应当作不存在。[14]

分析灵敏度描述某一抗体对照在规定条件下能够被可靠检出的最低水平。它不是对所有患者ADA的统一检出下限，因为患者反应通常是不同表位和亲和力抗体的混合物。筛查判定阈值（cut point）则根据相关人群的背景信号和方法变异确定，承担区分候选阳性与背景的功能。统计上允许的筛查假阳性比例，不是患者发生ADA的概率，更不是临床危险阈值。确证和中和各有自己的判定逻辑，不能把一个层级的cut point复制到另一个层级。

阳性对照既用于建立灵敏度，也用于证明低水平反应在两层检测中稳定可见；它的亲和力与表位决定这一证明覆盖哪类反应。该文件对常规IgG/IgM筛查与确证提出100 ng/mL或更好的灵敏度建议，同时允许依风险和既有知识论证其他目标。灵敏度需按未稀释样本基质回算，并校正最低必要稀释倍数（minimal required dilution，MRD）；NAb与IgE检测有各自的性能考虑。[2]

基线样本应在首次研究给药前取得，用于判断是否已有药物反应性抗体。基线阴性、给药后转为阳性的反应称为治疗诱导ADA；基线阳性、给药后滴度超过预先规定且具有分析依据的增长幅度，则可称为治疗增强ADA。二者共同构成治疗期间新出现或增强的ADA（treatment-emergent ADA）。基线阳性但未达到增强条件的反应，不应仅因治疗后仍阳性就计作治疗诱导反应。基线缺失或无法判定时，也不能自动假设给药前没有抗体。[13,14]

增强判定的倍数应能超过该方法的稀释级差和变异。文献中的四倍、九倍或其他约定并不是适合所有产品、所有稀释体系的普适生物阈值。瞬时与持续反应也需要结合采样间隔、末次阳性位置及后续是否有足够观察定义。Shankar等的术语共识采用保守的操作分类，将仅在末次访视检出的治疗诱导ADA计入persistent ADA，以保留后续追踪的需要。报告时仍应同时给出实际观察到的持续期及末次阳性后的随访范围：操作性标签与已经观察到长期持续描述的是不同信息。[13]

采样设计应覆盖给药前背景、治疗中的应答形成与后续持续性，并与药物和关键PD读出在时间上联结。给药后很早的样本可能尚未覆盖成熟的抗体反应；只在长期随访中采样可能漏掉短暂反应；停止治疗后过早采样则可能仍受残留药物影响。停药后追踪的时长还取决于药物半衰期、方法drug tolerance、ADA持续性和潜在后果。需要观察的是免疫反应的时间过程，不是让所有产品使用同一张访视日程。[2,3]

“研究期间ADA阳性的受试者比例”“某个访视点阳性比例”“阳性样本占全部样本的比例”是三个不同量。受试者若被重复采样多次，按样本计数会给予其更大权重；按“曾经阳性”计数则会随着观察窗口和采样密度扩大而增加检出机会。发生比例还必须说明分母是否仅含具有可评价基线和治疗后样本的受试者，以及检测受干扰、缺失与退出者如何处理。比例报告应保留分子、分母、适当的置信区间及不可评价比例，并说明退出和随访长度差异。NAb若只在ADA阳性对象中检测，其阳性数除以被检测对象得到条件比例；全体可评价受试者的NAb口径需要另行说明未测对象如何处理。[13,14]

ADA的影响取决于抗体结合在什么位置、以什么强度和数量存在。结合活性位点或邻近区域的抗体可直接阻断功能；结合其他区域的抗体可以改变药物构象、细胞摄取或与清除相关的相互作用。药物–抗体复合物的大小、组成及被受体识别的方式，可能使药物清除加快，也可能延长某些药物相关物质在循环中的存留。中和与清除不是互斥分类，同一反应可同时产生两种作用；“非中和”也不等于“临床无关”。[1,3]

Bartelds等2007年的前瞻性观察纳入121例类风湿关节炎患者，预设观察窗口为28周，血清在基线及第4、16、28周给药前取得。研究使用当时新开发的放射免疫分析检测高结合强度（avidity）的IgG抗adalimumab抗体，报告21/121例在观察期内检出抗体；抗体阳性组第28周adalimumab浓度中位数为1.2 mg/L，阴性组为11.0 mg/L，抗体组的疾病活动改善也较小。这是一个把抗体、谷浓度和临床反应联结起来的代表性研究。[8]

Kishnani等对早期婴儿型Pompe病资料的回顾性分析，将21例CRIM阳性和11例CRIM阴性患者的结局与抗体反应联系起来。患者来自临床试验和扩大使用资料，在研究入组条件下接受CHO来源重组GAA。治疗52周时，死亡或需侵入性通气这一复合结局发生于6/11例CRIM阴性患者和1/21例CRIM阳性患者。可获得抗体检测资料的分母却为8例CRIM阴性和20例CRIM阳性，其中分别为8/8和18/20检出IgG。临床结局分母与抗体可评价分母不相同，不能写成全体32例均进行了相同抗体随访。[9]

Casadevall等2002年的研究分析了13例在epoetin治疗中发生纯红细胞再生障碍的患者。患者血清能抑制正常骨髓细胞的红系集落形成，并检出抗erythropoietin抗体；相应对照血清未显示同样结果。这种功能证据把抗体与正常红细胞生成所需的内源蛋白联系起来，说明免疫原性不仅可能削弱给药作用，也可能妨碍正常生理功能。该病例系列来自已发生事件的人群，没有全部暴露患者的分母，因而不能从13例推算当时或现今产品的事件发生率，也不能凭它单独确定是哪一种制剂变化触发了反应。[11]

免疫原性风险不能仅用ADA发生比例表示。首先要识别反应可能发生的条件，包括产品状态、既有耐受、治疗背景和暴露过程；其次判断一旦发生，可能失去哪些治疗或生理功能，后果是否严重且难以逆转；最后评估目前的研究是否能够及时发现并解释该风险。一个ADA比例很低、却可能交叉中和不可替代内源蛋白的产品，不能因此被归为后果轻微。相反，低水平短暂结合抗体的比例较高，但未改变关键PK、PD和临床结果，也不能只以阳性比例认定其临床风险很高。

非临床ADA资料首先用于解释动物研究中的暴露、药效和毒性变化。动物将人体蛋白识别为外来抗原，其HLA对应系统、耐受背景和反应条件也与人不同，所以动物形成抗体并不直接预测人体发生率，动物不形成抗体也不能保证人体无风险。ICH S6(R1)明确强调这一预测限制。[17] 不同上游工具对应不同输出：计算分析识别潜在HLA结合肽，MAPPs观察规定细胞中实际呈递的肽，供者T细胞试验观察反应潜能，耐受动物模型检验某一产品状态的机制假设。HLA供者覆盖、既有T细胞库、抗原摄取与细胞成熟背景决定这些输出的适用范围；临床纵向资料再把反应与患者暴露和结局联结。[3,5–7]

免疫原性相关开发工作通常跨越产品表征、免疫机制研究、生物分析方法开发、临床样本检测、PK/PD建模与药物警戒。早期工作的输出应是明确风险假设和观察方案；临床前至早期临床的方法工作，应建立适用于预期样本条件的检测能力；关键临床阶段则需要能够支持最终评价的验证、完整样本流转和纵向数据。若委托不同机构完成这些环节，关键衔接点是方法版本、关键试剂、样本状态、药物干扰条件和受试者级定义能否追溯。这些衔接信息使各机构的报告成为同一条可审阅的证据链。[2–4,14]

FDA的2014年正式指导文件提供治疗性蛋白免疫原性风险框架，2019年正式文件细化ADA方法开发与验证。EMA治疗性蛋白免疫原性指南修订版于2017年5月18日采纳、2017年12月1日生效。中国CDE发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》为2021年第25号正式文件，公告署日期为2021年3月5日。三者共同强调产品和人群特异的评价、可靠的分层检测以及免疫反应与PK、PD、疗效和安全性的综合解释，文件中的技术建议不能被改写为脱离场景的全球统一阈值。[1–4]

生物类似药评价也需要区分免疫原性比较与独立疗效比较试验。EMA于2026年3月采纳关于量身调整临床开发的反思文件：对于可以充分表征并已显示理化与功能相似的产品，比较疗效研究不再被普遍期待；比较PK研究仍是重要组成部分，并提供支持性的安全与免疫原性资料。若已知相关ADA出现较晚、且可能影响疗效或安全性，单次给药PK研究的免疫原性窗口可能不够，需要相应延长观察或采用多次给药设计。[15]

当前评价已能够较系统地识别药物反应性抗体，区分部分功能后果，并把许多观察结果放到PK与临床背景中解释。仍未解决的关键问题是：哪些上游条件足以把某个产品在某个人群中的反应，从短暂低水平结合转变为持续、功能相关或具有交叉反应的应答。现有呈递、细胞和动物模型分别观察这一过程中的部分环节，尚不能用一个读出把所有层次闭合。

生物药免疫原性是产品、宿主与治疗过程共同产生的动态现象。可靠评价的基本单位，不是脱离条件的一个阳性率，而是具有明确采样时间、检测能力和基线背景的抗体结论，以及它与药物处置、功能和临床结果的联系。发生机制用于提出风险假设，分析方法规定何种反应可被看见，临床与上市后证据判断其后果。把这三部分连贯组织起来，才能既识别严重风险，又避免将可检测但尚无临床影响的反应误读为等量的危害。