# 生物药免疫原性的发生机制与评价体系 - 原文: https://omics.asia/blog/biologics-immunogenicity-assessment/ - 发布日期: 2026-10-14 - 作者: 库珀 - 主题: 生物, 抗体治疗 - 语言: zh-CN - 引用要求: 引用请注明文章标题、作者和原文链接。未经许可不得整篇转载或用于训练。 > 从免疫耐受、抗药抗体形成和检测判读出发，解释治疗性蛋白免疫原性的多因素风险、临床后果与全生命周期评价 ## 摘要 治疗性蛋白进入人体后，可能被免疫系统识别并引发非预期的免疫应答。抗药抗体是最常用的观察窗口，但抗体形成、抗体被检测到以及抗体产生临床后果，是三个各有不同证据要求的问题。免疫原性取决于药物的结构与质量状态、宿主对相关抗原的耐受、疾病与治疗环境，以及随时间变化的暴露；其临床意义又取决于抗体的表位、亲和力、持续性、中和能力、免疫复合物行为及内源蛋白交叉反应。本文以治疗性蛋白、抗体和酶替代产品为主要对象，沿抗原识别、T/B细胞协作、抗体测量和临床解释的过程，比较免疫原性的主要发生路径与评价方法。代表性临床研究显示，同一抗体阳性结果可以对应明显药代变化、特定条件下的功能抑制，也可以不产生可辨认的临床影响。可信评价因此需要把分析方法、采样条件和患者纵向资料联结起来，并以发生可能性、后果严重性和现有证据的不确定性组织风险判断。 ## 一、免疫原性评价的对象与中心问题 本文讨论生物药引起的非预期免疫反应，重点是治疗性蛋白及其衍生物，包括单克隆抗体、融合蛋白、替代性酶和与内源蛋白相对应的重组产品。疫苗希望诱导的特异性免疫反应不在此范围；细胞与基因治疗中的载体、转基因产物和细胞免疫排斥也不能直接套用本文的蛋白药物检测框架。FDA与中国指导原则采用的免疫原性概念均较“产生抗体”更宽，包含对药物或相关蛋白的免疫应答以及免疫相关不良事件；ADA检测则主要观察这一问题中的体液免疫部分。[1,2,4] 抗药抗体（anti-drug antibodies，ADA）是能够结合药物的抗体总称。中和抗体（neutralizing antibodies，NAb）是其中在规定功能体系内干扰药物活性的抗体。ADA可以不具有被测到的中和能力，却通过改变药物分布或清除影响暴露；NAb可以在体外存在，但因浓度、持续时间或体内接触条件不同而尚未造成可测的疗效改变。相反，严重输注反应可以发生在治疗诱导的ADA尚未形成时，涉及预存抗体、补体或药物自身对免疫细胞的作用。因此，“未发现ADA”“发现ADA”和“免疫相关事件”均需要明确其所观察的对象。[1–4] 评价体系应依次回答三个层次的问题。第一，哪些过程使这一产品在这一人群中具备引发反应的可能性？第二，研究是否以足够可靠的方式观察到了抗体的发生和演变？第三，这些反应是否影响了药代动力学（PK，药物的体内处置与浓度变化）、药效动力学（PD，药物引起的生物效应）、疗效或安全性？前两层为第三层提供证据，却不自动决定第三层的答案。本文选择聚集蛋白机制研究、抗TNF临床观察、婴儿型Pompe病酶替代研究以及少量机制明确的安全事件作为代表，分别说明耐受破坏、测量依赖和临床后果，不据其抗体阳性比例排列产品优劣。 ## 二、从抗原接触到抗药抗体形成 ### 2.1 抗原呈递与T细胞帮助 有效的ADA应答需要抗原接触、免疫细胞激活及反应延续的条件共同成立。一个重要路径起始于抗原呈递细胞，尤其是树突状细胞，对药物分子或颗粒的摄取。摄入的蛋白在细胞内被加工成肽段，其中部分与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子结合；在人类中常讨论HLAⅡ类分子。肽–HLA复合物被展示到细胞表面，具有匹配T细胞受体的CD4阳性T细胞才可能识别它。完整蛋白的空间表面与呈递给T细胞的线性肽段是不同对象，这也是B细胞表位与T细胞表位不能混为一谈的原因。[5] T细胞的有效启动还依赖抗原呈递细胞的成熟状态、共刺激分子和局部细胞因子。这些因素共同影响T细胞的激活与分化，或使其进入低反应和受抑制状态。HLA差异影响哪些肽可被呈递，宿主既有T细胞库则影响是否存在能够识别这些肽的细胞。这些条件使同一蛋白在不同人群中产生不同反应。结构或序列上的“可呈递肽”预测描述潜在呈递机会，实际呈递资料描述特定细胞中出现的肽，T细胞试验观察后续激活；最终ADA还取决于B细胞参与及反应能否延续。 ### 2.2 B细胞识别与抗体应答的延续 B细胞首先借助表面的B细胞受体识别药物的可接近表位。这些表位可以由蛋白折叠后相邻的不同片段共同构成，也可以包括修饰或糖结构。结合之后，B细胞摄取抗原、加工蛋白并呈递肽段；已被激活的辅助性T细胞若能识别该B细胞呈递的相关肽，便可能通过接触信号和细胞因子帮助B细胞扩增和分化。这里需要的是对同一被摄取抗原的关联识别，并不要求T细胞和B细胞识别相同的一段结构。[5] 在经典T细胞依赖的抗体应答中，一部分活化CD4 T细胞分化为滤泡辅助性T细胞（T follicular helper cells，Tfh），参与滤泡和生发中心内的B细胞选择。T细胞表面的CD40配体（CD40L）与B细胞CD40接触，IL-21等细胞因子作用于B细胞，分别提供接触性与可溶性帮助信号。这些信号支持增殖、选择和抗体分泌细胞分化；基础免疫研究通过阻断相关信号及观察生发中心输出，建立了这些环节的功能联系。[19] 获得帮助的B细胞可先在滤泡外形成较早的浆母细胞应答，也可进入生发中心。类别转换改变免疫球蛋白重链的恒定区及效应功能，可以在早期活化阶段、生发中心形成之前启动；进入生发中心的B细胞则通过体细胞高频突变和选择进一步完成亲和力成熟。类别转换与结合亲和力成熟因此是两种可区分的变化。[19,21] 分化后的浆细胞负责分泌抗体，其中长寿命浆细胞可在骨髓等生存环境中长期维持分泌；记忆B细胞主要保存再次应答的能力，在后续抗原接触时被重新动员。人骨髓研究将长期存在的抗病毒抗体与特定浆细胞群联系起来，为持续分泌这一机制提供了人体证据。[20] 这些基础机制解释了抗体持续性为何可能来自长寿命分泌细胞，也可能受再次暴露影响。临床ADA资料中的初次阳性时间、滴度变化和类别变化记录反应演变；其具体细胞来源和再次应答能力，需要相应的纵向或细胞证据来识别。 免疫原性也不是只有一种完整的经典应答路径。高度重复排列的表位可能增加B细胞受体的交联，为直接B细胞激活提供条件；但在蛋白药物语境中，把这一路径简单称作“无T细胞参与”可能过度推断。van Beers等在表达人体干扰素β、对其具有耐受的转基因小鼠中观察到：不同聚集状态的产品产生不同结合抗体反应，而该模型中未检测到中和抗体或再次挑战后的增强应答。[6] 随后的Kijanka等研究却发现，同类耐受模型的早期抗体形成需要CD4阳性T细胞，且可出现生发中心，同时仍缺乏典型的抗原特异性记忆增强。[7] 这些结果说明，ADA形成可以同时呈现若干T细胞依赖和非经典特征，生发中心、抗体分泌与记忆形成需分别观察。把这些模型环节用于解释人体产品时，还需以其耐受背景和临床纵向资料建立联系。 ![图1A：完整蛋白表位的B细胞识别与肽–HLA的T细胞识别分开；两路在T细胞帮助下关联。重复表位为条件分支，耐受分别限制T及B应答。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-01-A.svg "图1A｜治疗性蛋白诱导抗体应答的主要环节") ![图1B：获助B细胞可早期滤泡外分泌或进入生发中心。GC直接输出抗体分泌细胞，同时可形成部分長寿命浆细胞和记忆；记忆再次接触后才动员。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-01-B.svg "图1B｜治疗性蛋白诱导抗体应答的主要环节") [查看完整图1](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/fig-01-full.svg) 图1　治疗性蛋白诱导抗体应答的主要环节。抗原摄取与肽–HLA呈递进入T/B细胞关联识别及帮助过程；早期滤泡外分泌、生发中心亲和力成熟、长寿命浆细胞分泌和记忆再次动员分别表示。类别转换可在生发中心形成前启动，重复表位相关激活为条件性分支。既有耐受与调节作用可限制不同环节的应答。[5–7,19–21] ## 三、免疫耐受及其被打破的条件 ### 3.1 人源性与既有免疫耐受 免疫耐受是免疫系统能够识别特定抗原，同时维持不发生有害应答的状态。中枢耐受在淋巴细胞发育过程中减少对自身成分具有强反应性的细胞；外周耐受则依赖低反应状态、缺乏充分共刺激、调节性细胞及其他抑制机制。正常生理状态下接触自身蛋白支持耐受形成；蛋白的存在量、组织分布、表位加工和淋巴细胞接触机会，则影响这种耐受覆盖哪些形式和表位。[1,3] 重组人蛋白因来源于人体蛋白而可能享有部分既有耐受，却仍可能因缺失的内源对应物、改变的结构或异常的暴露环境而引起反应。完全人源抗体仍具有独特的抗原结合区，其修饰、聚集状态与患者免疫环境共同影响应答。Bartelds等针对完全人源adalimumab的临床观察就是一个明确例子。[8] 人源化程度由此进入风险背景，而产品特异性评价进一步考察实际结构、质量与临床使用条件。 替代治疗尤其能显示内源抗原与耐受之间的关系。若疾病使患者不表达某个内源蛋白，治疗用的正常蛋白对于其免疫系统可能更接近一个新的抗原；如果患者仍表达失去催化活性的蛋白，则可能保留对部分表位的耐受。Pompe病由酸性α-葡萄糖苷酶（acid α-glucosidase，GAA）缺陷引起，溶酶体内的糖原清除受到影响；替代酶需要进入细胞并到达相关作用部位。这里的交叉反应免疫物质（cross-reactive immunologic material，CRIM）状态用于区分能否检出内源GAA蛋白，并不等同于该蛋白具有正常功能。CRIM状态提供宿主抗原表达的信息，抗体的持续强度、功能及疾病进展资料则进一步区分这一背景内的风险差异。[9,10] ### 3.2 聚集、化学变化和杂质的多环节作用 聚集并不是一个具有单一生物作用的材料名称。可溶性寡聚体、亚可见颗粒与较大颗粒在数量、尺寸、表面形态、蛋白构象和化学变化上不同。它们可能增加重复表位的密度，改变抗原摄取，改变加工后肽段的数量或组合，并在某些条件下促进抗原呈递细胞成熟。这些变化可在同一样品中并存。解释聚集相关反应时，需要沿材料属性、抗原摄取、呈递和细胞激活追踪作用位置；人体风险的大小还取决于实际暴露与宿主条件。 Rombach-Riegraf等以两种模型IgG1抗体为对象，比较未受应力样品与经不同强度物理应力形成的聚集样品。研究采用了超过上市产品典型水平的应力和颗粒条件，用于观察材料状态可能作用于哪些免疫环节。[5] 研究分别设置了不同读出。树突状细胞分支观察人单核细胞来源细胞的成熟标志；MHC相关肽蛋白组学（MAPPs）分支在外加LPS成熟刺激的背景下，观察HLA-DR所呈递的药物来源肽；另一分支观察体外T细胞反应。成熟标志、实际呈递和T细胞反应对应不同对象，各分支处理条件也需分别理解。[5] 高聚集样品可提高部分成熟和呈递读出，说明颗粒状态能够影响免疫应答的上游环节。这些资料支持机制可能性与条件依赖，尚不足以确定正常商业批次中少量颗粒的临床效应；MAPPs中的呈递肽增多，也不能单独归因为颗粒导致树突状细胞成熟。[5] 分子化学变化还可在聚集之外改变识别对象。氧化、脱酰胺等可能改变残基化学性质、局部构象和稳定性，进而影响蛋白的加工、肽呈递或聚集倾向；融合蛋白的连接区把原有片段置于新的结构环境，可能引入连接区表位，某些应答还可扩展至其他相连区域。糖基化一方面可增加溶解度、降低聚集并遮蔽部分蛋白表位，另一方面，特定非人糖结构本身可成为抗体识别对象。聚乙二醇（PEG）修饰同样可降低部分蛋白表面的可接近性，但抗PEG反应可能影响修饰药物的处置与活性。产品评价因而需分别观察蛋白主体、连接关系、糖或其他修饰的识别，以及这些变化对材料状态的影响。[1] 不同聚集物的效应也不必随其总量或尺寸单调变化。干扰素耐受小鼠研究显示，保持的蛋白结构、聚集性质和模型耐受状态共同影响结果。[6] 颗粒尺寸与表面影响免疫细胞如何接触材料，保留或改变的分子结构影响可识别表位，而颗粒数量影响接触量。产品表征将这些性质分开记录，再与免疫细胞读出和临床ADA资料联结，才有助于定位风险来源。 工艺相关杂质可作为独立抗原，也可能改变应答环境。宿主细胞蛋白、残留核酸、微生物来源成分和其他污染物不能用同一个机制概括；某些成分能够刺激先天免疫，某些成分主要提供外来抗原，另一些成分可能通过促进产品降解或颗粒形成间接影响风险。制剂辅料、容器浸出物和临床使用时的材料接触同样需要放到具体产品状态中解释。因此，杂质的性质、水平、活性与变化，需要与其可能提供的抗原、先天免疫刺激或产品损伤路径对应起来。[1,3,4] ![产品因素分别作用于接触、呈递、激活或独立抗原应答。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-02-A1.svg "图2A1｜产品状态的作用位置") ![宿主与环境改变作用条件；连接、糖或PEG也可自身被识别。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-02-A2.svg "图2A2｜修饰、宿主与治疗环境") ![图2B：由因素映射续接抗原接触、加工呈递、激活和应答延续；结局并列为无持续、短暂或持续应答。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-02-B.svg "图2B｜产品状态与免疫环境共同影响应答") [查看完整图2](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/fig-02-full.svg) 图2　产品状态与免疫环境共同影响应答。图中分别表示抗原结构改变、重复表位、抗原摄取及先天免疫环境，不把聚集或杂质画成直接导致ADA的单一箭头。宿主耐受、HLA和疾病环境作用于不同节点，终点包含无持续应答、短暂应答和持续应答。[1,3,5,6] ## 四、产品、宿主和治疗环境的相互作用 ### 4.1 不同治疗模态的主要风险问题 评价抗体时，重点常包括独特抗原结合区、完整分子与片段的抗体结合、靶点及Fc相关因素，以及免疫复合物对药物处置的影响。替代酶除需观察结合外，还要区分抗体是否抑制催化活性、阻断细胞摄取或改变组织递送。替代细胞因子、激素和其他内源蛋白对应物，需要特别关注抗体是否同时中和具有重要生理功能的内源蛋白。相同的NAb阳性，在“失去外源治疗作用”和“同时失去正常生理功能”两种情形下，后果严重性明显不同。[1,3,9,11] 融合蛋白、多特异性抗体、聚乙二醇化蛋白和抗体偶联产品则可能引出组分层面的识别问题。初筛与确证通常以完整药物为对象，检测到反应后可用域特异性表征区分抗体针对蛋白主体、连接或修饰部分、某个功能域，还是其他组分。全分子作为检测试剂时，其构象、固定化或标记方式仍影响表位可接近性，对各临床相关域和修饰的检出覆盖需要验证。某些多功能域产品也可能需要多个检测共同实现覆盖。整体策略由产品风险与测量条件决定，而域特异性结果进一步说明可能影响哪一种功能及是否存在交叉反应。[2–4] ### 4.2 宿主状态与抗原接触历史 遗传差异既影响抗原呈递，也影响内源对应蛋白是否存在。年龄、免疫系统成熟或衰减、炎症活动、感染与免疫功能受损均可改变应答环境。适应证改变患者群体与治疗条件，同一药物的ADA资料也需按这些背景分别解释。炎症较活跃的人群可能获得较强共刺激，但疾病严重程度、蛋白丢失、靶点负荷和伴随治疗又可能同时改变暴露和抗体可检测性。疾病因素因此既是生物学影响因素，也可能是解释临床关联时的混杂因素。[1,3] 预存抗体是给药前已经存在的药物反应性抗体。其来源可以是此前接受相关产品、对环境抗原的交叉反应或其他既有反应，并不要求患者曾接受完全相同的药物。Chung等在cetuximab治疗前的血清中检出针对其Fab区糖表位α-gal的IgE，并发现它与部分患者首次给药时的过敏反应相联系。[12] 这一例子说明，首次暴露时的严重反应可以来自既有免疫识别，不能归为刚刚给药后从头形成的IgG ADA；蛋白序列之外的糖结构也可能成为临床相关表位。 ### 4.3 给药过程与伴随治疗 给药途径改变抗原最初接触的组织和细胞，给药频率与持续时间改变抗原暴露及再次刺激的机会。皮下、静脉及其他途径的风险必须结合产品、制剂和人群评价，不能作为跨产品绝对排序。间歇给药和长时间停药后再暴露可能改变既有反应，也会改变采样时药物干扰的程度。暴露量的作用同样并非统一单调规律：更充分的抗原接触、药物自身的免疫调节作用和检测遮蔽可以朝不同方向影响观察结果。[1,3] 伴随免疫抑制或免疫调节治疗可能降低ADA形成，但其影响依赖病种、具体药物和治疗历程。若临床开发主要在联合治疗中完成，其低ADA结果不能无条件外推到单药情形。另一方面，观察到合并用药与较低ADA关联，也不自动证明合并用药是唯一原因；患者选择、疾病控制和暴露差异均需纳入解释。风险评价应记录实际治疗背景，而不是在统计汇总中把它压缩成“有或无合并治疗”。[3,8] ## 五、ADA检测的层级与结果判读 ### 5.1 结合筛查、特异性确证与功能表征 分层检测首先使用较敏感的结合抗体筛查，以减少低水平反应被遗漏。筛查信号可以来自真正ADA，也可能来自非特异性结合或样本基质。因此，筛查阳性用于选择需要确证的样本，最终ADA状态由结合特异性等资料共同形成。确证层通常利用药物竞争等方式，检验该信号是否与药物特异性结合一致。结合两层结果后，才能形成样本级ADA结论。[2–4] 检测格式规定信号如何形成。桥联格式依靠ADA同时结合捕获药物与带标记药物，使被保留的标记形成可读信号；使用抗人免疫球蛋白二抗的间接结合格式，则通过二抗识别已经结合药物的抗体，检出范围受二抗的同种型覆盖影响。液相结合格式减少某些固定化相关的表位变化，但洗涤、分离与抗体解离速度仍会影响回收。ELISA或电化学发光主要描述读出平台，桥联或间接结合描述分子连接方式，两者属于不同层级。[2,4] 不同格式会看见不同类型的反应。桥联要求抗体保持连接两个药物试剂的能力，快速解离的结合或功能性单价反应可能较易漏检。IgG4可通过Fab-arm exchange交换半分子，形成两个臂具有不同特异性的抗体；在某一特异性上呈功能性单价时，它对同一药物的桥联能力可能下降。FDA因此提示桥联对IgG4可能检出不足，并非所有IgG4均无法检出。[2,22] 对早期、低亲和力或不同类别的反应，覆盖评估需要把抗体性质、试剂呈递形式和信号形成条件联系起来。 确证阳性样本的滴度用于描述反应强度。典型滴度是样本经过系列稀释后，仍满足阳性判定的最高稀释比例的倒数（例如1:1000对应滴度1000），或按预定规则由稀释曲线推得的值。它是依赖方法的准定量结果：不同抗体的亲和力、表位、类别和多价结合方式，会使相同质量浓度产生不同信号。因而，同一方法内的纵向滴度变化通常比跨方法比较“1:1000”和“1:2000”更可解释；将滴度解释为抗体质量浓度，需要与相应抗体及方法特征匹配的额外校准。[2,13] 中和检测进一步询问这些抗体在指定体系中是否阻断药物功能。药物若刺激受体信号，NAb可表现为相应信号下降；药物若阻断某个配体或受体，NAb反而可能恢复原先被抑制的信号。中和读出的方向由药物原来的作用决定。细胞体系较接近药物作用过程，但容易受细胞状态和样本内其他活性因子影响；配体结合或酶活性体系更直接地观察某个关键功能，却可能遗漏摄取、信号传递或其他作用环节。选择应由作用机制和需要排除的替代解释决定。[2] NAb阴性只表示在该方法能力和样本条件内未发现所定义的功能阻断。若方法不覆盖受体介导的酶摄取，则不能借催化活性阴性排除摄取被抑制；若残留药物或基质影响功能读出，也不能把结果当作纯抗体效应。另一方面，结合ADA也可能通过增加清除影响药效，即使中和试验阴性仍值得分析PK。评价必须说明检测到了哪一类抗体行为，以及哪一类临床机制尚未被该读出覆盖。 ### 5.2 药物干扰与drug tolerance 样本内残留药物能够占据ADA的结合位点，或使抗体以药物–抗体复合物形式存在。在需要ADA连接捕获药物与标记药物的桥联格式中，这会减少可供检测的结合能力，造成低估或假阴性。药物本身、可溶性靶点和其他内源成分也可能引起非特异性信号；在某些检测格式中，药物靶点形成的连接还能模拟抗体桥联。因此，药物干扰不仅是“信号被遮住”的问题，也包括信号来自错误对象的可能性。[2] Drug tolerance在这里指ADA检测方法对样本中药物干扰的耐受能力，与患者对药物的临床耐受或免疫耐受不同。它应描述在规定的ADA阳性对照水平和药物浓度下，方法仍能检测到ADA的能力，而不是一个可以脱离条件使用的单一数值。高水平、高亲和力的阳性对照可能在较高药物浓度下仍被检出，低水平或不同亲和力的患者ADA却可能被遮蔽。所以“方法可耐受某药物浓度”必须连同阳性对照、抗体水平、样本处理与判定方式解释。[2] 有些方法通过解离免疫复合物或富集抗体提高可检测性，但这也可能改变抗体回收、引入靶点相关干扰，或使某些不稳定抗体丢失。改进drug tolerance应同时观察特异性、选择性和不同反应类型的检出能力，而不能把“检测到更多阳性”视作改进的全部证据。对于长半衰期抗体药物，即使在下一次给药前采样，样本也可能仍有较高药物浓度；谷浓度采样降低干扰风险，却不保证已成为无药物样本。[2,3] 这一区别直接影响阴性结果的含义。FDA于2026年发布的免疫原性–PK数据集技术规范在其推荐的数据框架中，明确将样本级最终ADA结论与检测条件联结，需考虑检测耐受能力相对于药物浓度是否充分；不足时应使用“inconclusive”等不确定状态，而不能简单把无法可靠判定的样本归入阴性。受试者级状态再由其所有样本按预先定义规则推导。缺失样本、检测受干扰和真正阴性因而应分别保留，才能避免将未充分观察的反应当作不存在。[14] ![图3A：测量、候选阳性确证和检测条件共同进入样本级ADA结论。格式、同种型覆盖、相关人群背景、阳性对照与阈值是不同输入。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-03-A.svg "图3A｜分层检测与样本结论") ![图3B：阴性、阳性、不确定、缺失四类分开。阳性进行滴度与NAb表征，所有样本按预定规则纵向形成受试者级状态。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-03-B.svg "图3B｜分层检测与样本结论") [查看完整图3](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/fig-03-full.svg) 图3　分层检测与结果判读。筛查阳性进入确证，确证阳性进入滴度及必要的功能表征；药物浓度、drug tolerance和方法有效性共同影响每个样本能否给出确定结论。图中将“阴性”“阳性”“不确定”“缺失”分开，NAb结果不替代ADA结果。[2,4,14] ### 5.3 灵敏度、cut point与阳性对照的意义 分析灵敏度描述某一抗体对照在规定条件下能够被可靠检出的最低水平。它不是对所有患者ADA的统一检出下限，因为患者反应通常是不同表位和亲和力抗体的混合物。筛查判定阈值（cut point）则根据相关人群的背景信号和方法变异确定，承担区分候选阳性与背景的功能。统计上允许的筛查假阳性比例，不是患者发生ADA的概率，更不是临床危险阈值。确证和中和各有自己的判定逻辑，不能把一个层级的cut point复制到另一个层级。 FDA2019以约5%的筛查假阳性作为一般建议，使初筛优先保留低水平候选反应。竞争确证则依据抗体阴性的治疗前样本在加入竞争药物后的信号抑制分布建立cut point，通常按约1%的假阳性水平估计。筛查与确证的统计对象不同，这些比例描述各自分析分类的背景误差。[2] 阳性对照既用于建立灵敏度，也用于证明低水平反应在两层检测中稳定可见；它的亲和力与表位决定这一证明覆盖哪类反应。该文件对常规IgG/IgM筛查与确证提出100 ng/mL或更好的灵敏度建议，同时允许依风险和既有知识论证其他目标。灵敏度需按未稀释样本基质回算，并校正最低必要稀释倍数（minimal required dilution，MRD）；NAb与IgE检测有各自的性能考虑。[2] 方法验证因此需要在灵敏度之外证明：信号是否特异指向ADA，疾病基质是否影响识别，残留药物是否造成遮蔽，低阳性与阴性对照是否在不同批次运行中保持稳定，以及样本保存和试剂变化是否改变结论。方法更新后观察到更高ADA比例，可以来自检出能力提升，也可以来自真实生物差异。共同样本和桥接资料将仪器平台、关键试剂、检测性能与最终分类联系起来，有助于识别是哪一类变化造成结果差异。[2–4] ## 六、采样设计与ADA发生率的统计口径 ### 6.1 基线、治疗诱导与治疗增强 基线样本应在首次研究给药前取得，用于判断是否已有药物反应性抗体。基线阴性、给药后转为阳性的反应称为治疗诱导ADA；基线阳性、给药后滴度超过预先规定且具有分析依据的增长幅度，则可称为治疗增强ADA。二者共同构成治疗期间新出现或增强的ADA（treatment-emergent ADA）。基线阳性但未达到增强条件的反应，不应仅因治疗后仍阳性就计作治疗诱导反应。基线缺失或无法判定时，也不能自动假设给药前没有抗体。[13,14] 增强判定的倍数应能超过该方法的稀释级差和变异。文献中的四倍、九倍或其他约定并不是适合所有产品、所有稀释体系的普适生物阈值。瞬时与持续反应也需要结合采样间隔、末次阳性位置及后续是否有足够观察定义。Shankar等的术语共识采用保守的操作分类，将仅在末次访视检出的治疗诱导ADA计入persistent ADA，以保留后续追踪的需要。报告时仍应同时给出实际观察到的持续期及末次阳性后的随访范围：操作性标签与已经观察到长期持续描述的是不同信息。[13] 采样设计应覆盖给药前背景、治疗中的应答形成与后续持续性，并与药物和关键PD读出在时间上联结。给药后很早的样本可能尚未覆盖成熟的抗体反应；只在长期随访中采样可能漏掉短暂反应；停止治疗后过早采样则可能仍受残留药物影响。停药后追踪的时长还取决于药物半衰期、方法drug tolerance、ADA持续性和潜在后果。需要观察的是免疫反应的时间过程，不是让所有产品使用同一张访视日程。[2,3] ### 6.2 分母、检测窗口与比较条件 “研究期间ADA阳性的受试者比例”“某个访视点阳性比例”“阳性样本占全部样本的比例”是三个不同量。受试者若被重复采样多次，按样本计数会给予其更大权重；按“曾经阳性”计数则会随着观察窗口和采样密度扩大而增加检出机会。发生比例还必须说明分母是否仅含具有可评价基线和治疗后样本的受试者，以及检测受干扰、缺失与退出者如何处理。比例报告应保留分子、分母、适当的置信区间及不可评价比例，并说明退出和随访长度差异。NAb若只在ADA阳性对象中检测，其阳性数除以被检测对象得到条件比例；全体可评价受试者的NAb口径需要另行说明未测对象如何处理。[13,14] 产品之间的相对评价需统一病例来源、病种与治疗背景、观察期、采样策略和状态定义，并证明对两种产品的抗体具有相当检出性能。头对头设计为病例与采样提供共同条件，方法桥接则检验不同抗体被识别时的检测对称性。不同分子、不同病种的说明书比例更不宜做免疫原性排行榜。一个检出低水平短暂抗体能力较好的方法，可能报告更高的阳性比例，却同时提供更完整的临床风险证据。 ## 七、从抗体性质到药代、疗效与安全性 ### 7.1 中和与清除的作用路径 ADA的影响取决于抗体结合在什么位置、以什么强度和数量存在。结合活性位点或邻近区域的抗体可直接阻断功能；结合其他区域的抗体可以改变药物构象、细胞摄取或与清除相关的相互作用。药物–抗体复合物的大小、组成及被受体识别的方式，可能使药物清除加快，也可能延长某些药物相关物质在循环中的存留。中和与清除不是互斥分类，同一反应可同时产生两种作用；“非中和”也不等于“临床无关”。[1,3] PK测定本身还需明确是观察游离、可结合靶点的药物，还是包括部分结合状态的总药物相关物质。ADA改变复合物组成之后，不同PK方法可能给出不同结果。判断有效暴露时，必须把测量对象与药物作用所需的状态联系起来，不能只依据某个“总浓度仍然不低”排除功能影响。这同样解释了为何免疫原性评价需要PK、PD及临床终点，而非仅用抗体试验自我闭环。 ### 7.2 抗TNF案例中的生物学关联与检测耦合 Bartelds等2007年的前瞻性观察纳入121例类风湿关节炎患者，预设观察窗口为28周，血清在基线及第4、16、28周给药前取得。研究使用当时新开发的放射免疫分析检测高结合强度（avidity）的IgG抗adalimumab抗体，报告21/121例在观察期内检出抗体；抗体阳性组第28周adalimumab浓度中位数为1.2 mg/L，阴性组为11.0 mg/L，抗体组的疾病活动改善也较小。这是一个把抗体、谷浓度和临床反应联结起来的代表性研究。[8] 重要条件是，该研究明确指出药物会干扰抗体检测，并将阳性定义为抗体结果超过12 AU/mL且adalimumab浓度不高于5 mg/L；部分早期样本还依据药物浓度及第28周抗体状态选择检测。因此，这一历史方法更容易识别低药物浓度背景下的ADA。“ADA与低暴露相关”具有生物学解释，也包含检测策略带来的可观察性耦合，不能被当作完全独立的两项测量。[8] 阳性组和阴性组的甲氨蝶呤合用比例也不同。研究支持抗体检出、谷浓度与临床反应之间的关联，却不能独自证明所有低药物浓度或治疗不响应均由ADA造成，更不能将其17%直接移用于现代drug-tolerant方法或其他适应证。[8] ### 7.3 酶替代案例中的宿主耐受与功能终点 Kishnani等对早期婴儿型Pompe病资料的回顾性分析，将21例CRIM阳性和11例CRIM阴性患者的结局与抗体反应联系起来。患者来自临床试验和扩大使用资料，在研究入组条件下接受CHO来源重组GAA。治疗52周时，死亡或需侵入性通气这一复合结局发生于6/11例CRIM阴性患者和1/21例CRIM阳性患者。可获得抗体检测资料的分母却为8例CRIM阴性和20例CRIM阳性，其中分别为8/8和18/20检出IgG。临床结局分母与抗体可评价分母不相同，不能写成全体32例均进行了相同抗体随访。[9] 该研究的IgG采用酶联免疫分析筛查并以放射免疫沉淀确证；报告的持续高滴度在CRIM阴性组更显著。功能检测又区分酶催化活性抑制和细胞摄取抑制，但主要针对已有抗体且出现输注反应或临床下降的部分患者，不能将该子集的功能结果外推为全队列中和发生率。宿主缺乏内源GAA、较强持续抗体反应和较差结局之间的联系支持风险分层，却不消除小样本、回顾性设计及疾病严重程度等解释限制。[9] van Gelder等的荷兰研究提供了有价值的补充：11例经典婴儿型患者均形成抗体，包含8例CRIM阳性和3例CRIM阴性；按其自身ELISA定义，滴度高低并未与CRIM状态严格对应。研究为纵向随访，部分患者早期使用过不同来源的重组酶，治疗过程也存在剂量改变；每三个月给药前采样，以五倍稀释体系及相对于阴性对照的信号规则定义滴度。[10] 研究还取每位患者滴度峰值时的血清，观察外源酶进入GAA缺陷成纤维细胞的情况：在该酶与血清相对量条件下，只有三份最高滴度血清出现酶摄取抑制，而催化活性抑制的样本范围更宽。这个结果把“能结合酶”进一步分解为“是否抑制催化”和“是否阻断进入细胞”，使抗体的功能性质获得直接观察。[10] 两个研究共同说明：CRIM是重要风险背景，持续反应强度和功能作用提供额外信息；其滴度阈值的对应关系还取决于各自稀释、对照与判定规则。[9,10] ### 7.4 严重安全后果的机制证据 Casadevall等2002年的研究分析了13例在epoetin治疗中发生纯红细胞再生障碍的患者。患者血清能抑制正常骨髓细胞的红系集落形成，并检出抗erythropoietin抗体；相应对照血清未显示同样结果。这种功能证据把抗体与正常红细胞生成所需的内源蛋白联系起来，说明免疫原性不仅可能削弱给药作用，也可能妨碍正常生理功能。该病例系列来自已发生事件的人群，没有全部暴露患者的分母，因而不能从13例推算当时或现今产品的事件发生率，也不能凭它单独确定是哪一种制剂变化触发了反应。[11] 过敏、免疫复合物相关反应和细胞因子释放则需要分别追踪机制。ADA阳性并非过敏反应的充分条件；“输注相关”只说明时间联系，不能替代IgE、补体、细胞因子及其他机制的区分。特别是药物直接激活免疫细胞导致的细胞因子释放，可与抗体形成无直接关系。安全评价应保留事件发生时间、具体表现和相关功能证据，避免用一个含糊的“免疫原性反应”覆盖不同过程。[1,12] ![图4A：实际ADA可以经功能中和、清除或分布变化影响药物暴露和患者后果；内源蛋白交叉中和另列，疾病等背景分别影响ADA、暴露和结局。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-04-A.svg "图4A｜ADA临床关联与检测耦合") ![图4B：实际ADA经方法观察形成检出ADA，采样残留药物及方法版本、drug tolerance和采样选择规定可观察性。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-04-B.svg "图4B｜ADA临床关联与检测耦合") [查看完整图4](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/fig-04-full.svg) 图4　免疫原性临床解释中的时间关系与替代路径。ADA可通过中和或清除改变有效暴露，但疾病状态和伴随治疗也可同时影响暴露与结局；残留药物则影响ADA的可检测性。实线表示机制路径，虚线表示测量影响或需要控制的关联，不把观察性关联画成已经证实的单向因果关系。[8–11,14] ## 八、全生命周期的风险评价与证据整合 ### 8.1 发生可能性、后果严重性与证据充分性 免疫原性风险不能仅用ADA发生比例表示。首先要识别反应可能发生的条件，包括产品状态、既有耐受、治疗背景和暴露过程；其次判断一旦发生，可能失去哪些治疗或生理功能，后果是否严重且难以逆转；最后评估目前的研究是否能够及时发现并解释该风险。一个ADA比例很低、却可能交叉中和不可替代内源蛋白的产品，不能因此被归为后果轻微。相反，低水平短暂结合抗体的比例较高，但未改变关键PK、PD和临床结果，也不能只以阳性比例认定其临床风险很高。 “尚未观察到影响”的证据强度取决于研究规模、观察时间、反应类型和终点的敏感性。小型研究不足以排除罕见严重事件，短观察窗不足以排除迟发或持续反应，只有少量阳性者时也难以可靠比较其临床结局。风险结论应列出最可能的临床路径及尚不能排除的路径，并说明哪些新增观察能够改变判断，而不是把所有不确定性压缩为一个综合评分。 ### 8.2 非临床、临床与质量资料各自的作用 非临床ADA资料首先用于解释动物研究中的暴露、药效和毒性变化。动物将人体蛋白识别为外来抗原，其HLA对应系统、耐受背景和反应条件也与人不同，所以动物形成抗体并不直接预测人体发生率，动物不形成抗体也不能保证人体无风险。ICH S6(R1)明确强调这一预测限制。[17] 不同上游工具对应不同输出：计算分析识别潜在HLA结合肽，MAPPs观察规定细胞中实际呈递的肽，供者T细胞试验观察反应潜能，耐受动物模型检验某一产品状态的机制假设。HLA供者覆盖、既有T细胞库、抗原摄取与细胞成熟背景决定这些输出的适用范围；临床纵向资料再把反应与患者暴露和结局联结。[3,5–7] 临床研究则需要前瞻性联结抗体、药物浓度、PD、疗效和事件时间。受试者的ADA状态可能在研究中变化，仅按“曾经阳性”分为两组，会把抗体出现前的观察也归入阳性组；低暴露还可能先于可检测ADA。因此，纵向描述和适当的时间变化分析比只比较两组平均疗效更有解释力。模型分析可以控制部分协变量，却不能自动修复选择检测、未采样或drug tolerance不足造成的资料缺口。 质量资料连接的是临床受试产品与后续使用产品是否具有充分代表性。生产工艺、制剂、容器或使用方式发生变化后，风险评价需关注哪些质量属性改变、这些变化可能影响什么免疫环节，以及现有分析能否排除有意义的差异。ICH Q5E采用逐步可比性评价，强调质量证据并根据剩余不确定性决定是否需要非临床或临床支持；并不是每一项质量变化都自动要求同规模人体试验。[18] ### 8.3 检测服务与开发阶段的衔接 免疫原性相关开发工作通常跨越产品表征、免疫机制研究、生物分析方法开发、临床样本检测、PK/PD建模与药物警戒。早期工作的输出应是明确风险假设和观察方案；临床前至早期临床的方法工作，应建立适用于预期样本条件的检测能力；关键临床阶段则需要能够支持最终评价的验证、完整样本流转和纵向数据。若委托不同机构完成这些环节，关键衔接点是方法版本、关键试剂、样本状态、药物干扰条件和受试者级定义能否追溯。这些衔接信息使各机构的报告成为同一条可审阅的证据链。[2–4,14] 一份临床检测报告需要把结果对应到样本采集时间、方法版本、关键试剂与有效运行，并与同一受试者的药物浓度记录联结。后续统计报告再按基线和预定规则，从这些样本级结论生成受试者级ADA状态；方法变更或跨实验室交接的信息应随结果一起传递，使新的报告仍能与既有纵向记录对应。[2,14] NAb报告还应说明所观察的药物功能，使功能结果能衔接催化活性、受体作用或细胞摄取等相关临床路径。综合评价由质量、免疫学、生物分析、临床药理与临床安全专业共同完成：检测报告提供反应与测量条件，产品层面的判断再将它们与暴露、功能和临床后果整合。 ## 九、监管框架的共同原则与近年的调整 FDA的2014年正式指导文件提供治疗性蛋白免疫原性风险框架，2019年正式文件细化ADA方法开发与验证。EMA治疗性蛋白免疫原性指南修订版于2017年5月18日采纳、2017年12月1日生效。中国CDE发布的《药物免疫原性研究技术指导原则》为2021年第25号正式文件，公告署日期为2021年3月5日。三者共同强调产品和人群特异的评价、可靠的分层检测以及免疫反应与PK、PD、疗效和安全性的综合解释，文件中的技术建议不能被改写为脱离场景的全球统一阈值。[1–4] 2026年FDA发布的免疫原性–PK数据技术规范进一步强化了样本级结果、受试者级状态和药代数据的可追溯关联。它分别安排免疫原性样本、药物浓度与受试者层面的分析资料，并保留基线、检测层级、时间配对和不确定状态。这项调整并未改变免疫原性的生物学定义，而是使“某人的某次抗体结论与哪次药物浓度对应”能够被更明确地审阅。[14] 生物类似药评价也需要区分免疫原性比较与独立疗效比较试验。EMA于2026年3月采纳关于量身调整临床开发的反思文件：对于可以充分表征并已显示理化与功能相似的产品，比较疗效研究不再被普遍期待；比较PK研究仍是重要组成部分，并提供支持性的安全与免疫原性资料。若已知相关ADA出现较晚、且可能影响疗效或安全性，单次给药PK研究的免疫原性窗口可能不够，需要相应延长观察或采用多次给药设计。[15] FDA于2025年10月发布的比较疗效研究指导原则草案提出，在充分分析相似性的基础上，适当的PK相似性与免疫原性评价可能足以支持部分产品的开发，但保留对分析表征、结构–功能认识和临床相关PK可行性的条件。EMA已采纳的反思文件与FDA草案应按各自状态使用，不能统一称为全球已实施的新规定。减少信息增益有限的疗效研究，也不意味着免疫原性分析可以省略，或任意两个产品的ADA阳性比例已经可比。[15,16] 上市后资料继续承担发现罕见、迟发或特定人群风险的作用。真实使用中需要保留产品识别、相关批次和工艺变化、用药背景以及事件发生时间，才能探究可能原因。病例报告能够提示风险，却一般不能单独提供发生率；没有暴露分母和统一检测的被动报告，也不能替代比较研究。发现潜在信号后，应回到产品质量、检测证据和临床过程，逐项评估机制与其他解释。[3,11] ![图5A：质量、耐受机制和生物类似药比较范围限定产品与人群的风险假设；工艺、制剂或人群变化反馈到质量可比性。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-05-A.svg "图5A｜全生命周期的免疫原性证据整合") ![图5B：风险假设决定检测与采样，分析相似性和剩余不确定性决定比较任务规模；纵向临床证据和上市后信号进入风险判断，判断再更新假设。](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/panels/fig-05-B.svg "图5B｜全生命周期的免疫原性证据整合") [查看完整图5](https://omics.asia/article-assets/biologics-immunogenicity-assessment/figures/fig-05-full.svg) 图5　全生命周期的免疫原性证据整合。质量与机制资料提出风险假设，分析方法建立可观测条件，临床纵向数据建立抗体与暴露及结局的联系，上市后资料补充罕见和迟发风险。每个阶段均有反馈至风险评估的箭头；生物类似药的临床规模由分析相似性和剩余风险决定，而不以固定试验数量表示。[1–4,14–18] ## 十、未解决问题与综合判断 当前评价已能够较系统地识别药物反应性抗体，区分部分功能后果，并把许多观察结果放到PK与临床背景中解释。仍未解决的关键问题是：哪些上游条件足以把某个产品在某个人群中的反应，从短暂低水平结合转变为持续、功能相关或具有交叉反应的应答。现有呈递、细胞和动物模型分别观察这一过程中的部分环节，尚不能用一个读出把所有层次闭合。 要区分重要替代解释，需要与假设匹配的观察。如果认为产品颗粒改变驱动免疫反应，需把批次质量变化与免疫应答时间及功能表征相联结，而不只报告一个聚集指标；如果认为ADA导致暴露下降，需观察抗体变化与暴露变化的顺序、控制检测遮蔽并考察其他清除因素；如果认为既有耐受决定风险，需在可比条件下纳入内源蛋白表达、既有反应和治疗环境，并保留风险分类之外的个体差异。一个更灵敏的方法能够揭示过去看不到的反应，但新增阳性是否改变临床判断，仍要由反应性质和结局资料回答。 生物药免疫原性是产品、宿主与治疗过程共同产生的动态现象。可靠评价的基本单位，不是脱离条件的一个阳性率，而是具有明确采样时间、检测能力和基线背景的抗体结论，以及它与药物处置、功能和临床结果的联系。发生机制用于提出风险假设，分析方法规定何种反应可被看见，临床与上市后证据判断其后果。把这三部分连贯组织起来，才能既识别严重风险，又避免将可检测但尚无临床影响的反应误读为等量的危害。 ## 参考资料 - [[1] Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products](https://www.fda.gov/media/85017/download) — I–II；V.A.5；V.B.5–6；III.A；III.B.5；V.A；III.A；III.B.1–4；封面与官方页面；V.B.2与V.B.4，印刷pp14–17 - [[2] Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection](https://www.fda.gov/media/119788/download) — I及脚注4；IV.A.3 Domain Specificity；III.A；IV.A.1；V.C–D；V.C；IV.C.1；V.D.1–5；IV.C.2；IV.E；IV.L；IV.C.2；VII.A；IV.C.1，印刷p8；V.A，p17；VI.C，p25；VII.A；III.B；封面与官方页面；IV.I，印刷pp12–13；IV.A.2脚注17，印刷p6；IV.C.1，p8；IV.L.1 Pre-Existing Antibodies，印刷p16，two dilution steps；IV.C.1，印刷p8 - [[3] Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins](https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-immunogenicity-assessment-therapeutic-proteins-revision-1_en.pdf) — 4.1–4.2；4.2；4.1；4.1 Treatment-related因素及Concomitant treatment；7.3；8.1；7.3；8.1；5.1；8.2；封面履历 - [[4] 药物免疫原性研究技术指导原则](https://www.cde.org.cn/main/news/viewInfoCommon/a0908879d6c54c7318f0881611b51122) — 一、概述；三（一）1；正式公告；三（一）2，印刷p6 - [[5] Aggregation of Human Recombinant Monoclonal Antibodies Influences the Capacity of Dendritic Cells to Stimulate Adaptive T-Cell Responses In Vitro](https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0086322) — Introduction；Results：MAPPs；Introduction；Abstract；Results；Materials and Methods；2014-03-19 Correction；Discussion；Results：Aggregate processing；Figure 3B图注 - [[6] Aggregated Recombinant Human Interferon Beta Induces Antibodies but No Memory in Immune-Tolerant Transgenic 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